De werkwijze bij de zoektocht naar antimicrobiële verbindingen, die tussen 2026 en 2030 plaatsvindt, verloopt in grote lijnen volgens een blauwdruk die al bij vele andere onderzoeksprojecten binnen IBL succesvol is toegepast. Niet in de laatste plaats door de ondersteunende rol vanuit de analytische faciliteit.

Lina Bayona Maldonado, sinds 2025 hoofd van deze gemeenschappelijke faciliteit, kan daar ook als voormalig gebruiker over meepraten. “Mijn PhD-onderzoek stond in het teken van metabolomics van zeesponzen en het isoleren van bio-actieve stoffen uit deze in de natuur voorkomende verbindingen. Na mijn promotie in 2021 ben ik als postdoc gaan werken in het Van Wezel-lab in het kader van het onlangs afgesloten Europees project, genaamd MARBLES. Dit staat voor ‘Marine Biodiversity and Sustainable Resources of Disease-Suppressive Microbes and Bioprotectants for Aquaculture and Crop Disease’. Daarbij lag ook de focus op het vinden van bio-actieve moleculen, maar nu vanuit de interactie tussen spons en micro-organismen, waaruit chemische stoffen naar voren komen die de productie van bio-actieve componenten stimuleren.”

Het gros van de gebruikers van de analytische faciliteit houdt zich bezig met plantenonderzoek of microbieel onderzoek. Daarbij ligt de focus op secundaire metabolieten, afkomstig van planten of micro-organismen. Sommige onderzoeken richten zich op interacties tussen micro-organismen en plantenmicro-organismen, om te begrijpen welke moleculen deze interacties veroorzaken, of het product zijn van deze interacties. Startpunt bij dit alles is veelal een reeks metabolomics-experimenten, waarbij de volledige verzameling van aanwezige moleculen in kaart wordt gebracht. Dat kunnen er honderden tot wel duizenden zijn. Vervolgens vinden testen op bio-activiteit plaats, bijvoorbeeld op antimicrobiële activiteit. Uit combinatie van de twee datasets kunnen componenten worden geselecteerd die interessant zijn voor verder onderzoek, bijvoorbeeld omdat ze nieuw zijn of omdat ze een relevante bio-activiteit laten zien.

Als manager van de analytische faciliteit doet Lina geen eigen onderzoek meer, maar heeft zij een meer ondersteunende rol, waarbij haar onderzoekservaring van grote meerwaarde is. “Onderzoekers die aan een project beginnen adviseer ik over de experimentele opzet voor het metabolomics-onderzoek. Vervolgens begeleid ik ze bij het isoleren, of werk soms zelfs mee aan het proces van het isoleren en ontrafelen van de moleculen. Dat hangt ook samen met de wetenschappelijke achtergrond van de betreffende onderzoeker. Dit is een biologisch instituut, dus de meeste mensen zijn microbiologen of biologen; ze beschikken niet altijd over de benodigde analytisch-chemische expertise en vaardigheden om hun experimenten tot een goed einde te brengen.”

De mate van ondersteuning hangt ook samen met het aandeel analytisch werk in het onderzoek. “Bij projecten met een sterk moleculair-biologische insteek wordt soms maar sporadisch gebruik gemaakt van analytisch-chemische technieken. In dat geval is het niet zinvol om tijd te investeren in het aanleren van de technieken, en kunnen wij dat als experts op dit gebied beter zelf uitvoeren. Aan de andere kant, als een PhD-student aan het begin staat van zijn of haar onderzoek en aan isolatie van natuurlijke producten gaat werken, dragen wij de benodigde kennis graag over. Wat dat betreft proberen we met ons team, met mij zijn dat Paolo Innocenti uit de groep van Nathaniel Martin en Ozlem Erol uit de groep van Young Hae Choi, zoveel mogelijk maatwerk te leveren”, aldus Lina.

Als een metabolomics-monster de analytische faciliteit binnenkomt is het eerste station LC-MS of LC-MS/MS. “Hierbij gaat het om de identificatie van de meestal honderden, soms duizenden, verschillende componenten in het monster. Op basis van het MS-spectrum kunnen we op zoek naar matches in databases met bekende moleculen. Ook kunnen we informatie afleiden over de structuur van het molecuul, welk type molecuul het kan zijn, bijvoorbeeld een peptide of een flavonoïde. Op andere platforms kunnen we vervolgens actieve verbindingen identificeren. Nataliia Machushynets en Isabel Nuñez Santiago hebben in het kader van hun PhD-research bij het Van Wezel Lab enkele jaren geleden de ‘NanoRAPIDS Technology’ ontwikkeld, waarbij de LC-MS gegevens parallel worden gekoppeld aan een activiteitstest. Zo kun je uit het volledige chromatogram heel efficiënt een klein deel van de verbindingen selecteren dat verantwoordelijk is voor de activiteit”, vertelt Lina.

Na identificatie van verbindingen die interessant zijn voor verder onderzoek komt de tweede stap in beeld, het isoleren en opschalen. “Bij metabolomics werk je meestal met extracten in zeer kleine hoeveelheden, zoals 30 milligram of één agarplaat. Om die hoeveelheden op te schalen kan je fermentaties op literschaal uitvoeren of kilo’s plantmateriaal verzamelen, die je vervolgens moet extraheren. Om tot de uiteindelijke isolatie van het zuivere doelmolecuul te komen heb je verschillende chromatografietechnieken nodig. Doorgaans beginnen we met flashchromatografie, waarbij we het zeer ruwe extract met al die honderden, zo niet duizenden verbindingen terugbrengen tot beter hanteerbare fracties. In die fracties kunnen we dan nagaan of daar de verbinding in zit die we eerder hadden geïdentificeerd in het LC-MS-traject. Omdat de mengsels zo complex zijn, is een basislijnscheiding met flash meestal niet aan de orde. Daarom voeren we een tweede scheidingsstap uit met preparatieve HPLC of soms zelfs meerdere HPLC-rondes om tot de zuivere verbinding te komen.”

Tijdens de lange weg van uitgangsmateriaal naar eindresultaat gaat potentiële opbrengst verloren. “Om een voorbeeld te noemen. We kunnen 10 tot 15 liter agar of vloeibare kweek fermenteren, en daaruit halen we dan meestal twee tot drie gram ruw extract. Als alles meezit houden we aan het einde enkele milligrammen over van de zuivere stof. Het is dus zaak om er voor te zorgen dat elke stap in dat proces zo efficiënt mogelijk verloopt.”

Met de aanschaf van een systeem voor flashchromatografie, de C-950 van BÜCHI Labortechnik, zet de analytische faciliteit een nieuwe stap in die optimaliseringsslag. “Voorheen maakten we gebruik van open kolommen, die niet alleen veel minder efficiënt zijn, maar ook minder reproduceerbaar. Immers, ze zijn niet vooraf gevuld, dus het hangt deels van de instellingen en werkwijze van de gebruiker af hoe de scheiding uitvalt. Daarbij heb je met open kolommen geen manier om online te volgen wat er van de kolom af komt. Je moet min of meer op gevoel de fracties verzamelen en vervolgens met de LC-MS controleren wat er in welke fractie zat. Dat is vrij omslachtig. Nu zijn we in staat om al bij de eerste scheiding meer verfijnde fracties te verkrijgen. Daardoor kan ook de HPLC in de stap daarna met minder complexe fracties aan de slag”, legt Lina uit.

Het nieuwe apparaat is een combinatie van flash en prep, wat betekent dat in een adem door de stap van preparatieve HPLC op hetzelfde apparaat kan worden uitgevoerd. “Dat scheelt sowieso veel gedoe met monsteroverdracht naar andere ruimtes waar de preparatieve HPLC’s staan. En we houden er goed zicht op. Dat is met name belangrijk bij instabiele of anderszins kwetsbare componenten. De kans op degradatie is een stuk kleiner, wat ten goede komt aan de opbrengst.”

De voor deze flash-apparaten karakteristieke ELSD heeft opmerkelijk weinig impact op de opbrengst. Evaporative light scattering is een destructieve detectietechniek, dus alles wat de ELSD voor detectie opsoupeert gaat ten koste van de opbrengst. Dat kon in oudere generaties flash-instrumenten door het splitten van de monsterstroom wel oplopen tot 50%; niet echt handig als elke milligram opbrengst telt. In het nieuwe flash-apparaat worden via het principe van nanopulsatie hele kleine druppeltjes monster in de detectorkamer geschoten, circa 30 microliter per minuut. Dat komt neer op een veel kleiner monsterverlies, van minder dan 0,2 procent.

Iedere investering in instrumentatie is er op gericht om de productiviteit van het instituut te verhogen en de onderzoekers de mogelijkheid te bieden om nieuwe, spannende moleculen te isoleren waar verder onderzoek aan kan worden gedaan, stelt Lina. “Niets is zo vervelend als onderzoek vastloopt omdat je niet genoeg van het molecuul kunt verkrijgen om tests op bio-activiteit uit te voeren. Dat geldt zeker ook voor de onderzoekers die zich bezighouden met interacties, die in het algemeen meer opbrengst nodig hebben voor verdere experimenten. Die hebben vaak niet genoeg aan de één of twee milligram geïsoleerde component.”

Het proces efficiënter maken gaat niet alleen om meer verbinding overhouden. “Als je minder ver hoeft op te schalen om de gewenste hoeveelheid te verkrijgen boek je ook winst: minder werk, minder materiaal, minder oplosmiddel, minder tijd.”

De grootste winst is volgens Lina te behalen in de experimentele opzet, iets waar zij en haar collega’s graag in meedenken. “Veel beginnende onderzoekers die zich met metabolomics bezighouden, denken van ‘oké, we doen de LC-MS, en dan is het klaar’. Maar dan begint het werk pas. Want als je iets interessants vindt, moet je alles isoleren en identificeren, waar heel veel werk mee gemoeid is. Daarom is het belangrijk om je vanaf het begin te richten op de verbindingen die daadwerkelijk verband houden met de reactie of activiteit waarnaar je op zoek bent. Zodat je geen middelen verspilt aan iets dat al bekend is, niet-actief is of geen verband houdt met wat je wilt onderzoeken. Dan is het nog steeds geen fluitje van een cent, maar dat is met de gecombineerde flash/prep voor de isolatiestap wel ietsje dichterbij gekomen.”