Research analist Desiree Schut bewaart sinds kort de humane iPSC-derived neuronen in deze -150 °C vriezer van Haier Biomedical.

De afdeling ‘Functionele Genoomanalyse’ (FGA) van het Center for Neurogenomics and Cognitive Research (CNCR) in Amsterdam heeft recent geïnvesteerd in twee nieuwe -150 °C vriezers. Hiermee is er voorlopig weer voldoende ruimte voor de opslag van stamcellen en hersencellen, die er in het kader van het alsmaar toenemende onderzoek naar neurologische aandoeningen als Alzheimer en ALS worden gekweekt. Ook de onderzoeksgroep Neurospector, die als CRO (‘contract research organization’) succesvol farmabedrijven ondersteunt in pre-klinisch onderzoek, slaat er dit waardevolle onderzoeksmateriaal op.

Claudia Persoon is hoofd van Neurospector, de valorisatie afdeling die vanuit een gestandaardiseerd platform voor Humane iPSC-derived neuronen farmabedrijven ondersteunt bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnen voor neurologische aandoeningen.

De impact van een nieuwe vriezer op een begrip als duurzaamheid heeft onmiskenbaar te maken met actuele, sterk aangescherpte regelgeving rond koelmiddelen. De herziene Europese F-gassenverordening verbiedt inmiddels het gebruik van synthetische koudemiddelen met een aardopwarmingsvermogen (GWP) van 150 of hoger. Voor nieuwe -80 °C en -150 °C vriezers golden aanvankelijk nog vrijstellingen, omdat het niet zo gemakkelijk was om stabiele en veilige natuurlijke koudemiddelen te produceren, die deze lage temperaturen kunnen bereiken. Die uitzonderingspositie is inmiddels achterhaald, omdat door het restrictieve beleid de markt voor de traditioneel toegepaste fluorkoolwaterstoffen (HFK’s) dusdanig gekrompen is, dat ze schaars en extreem duur zijn geworden. Daar doet een uitzonderingsclausule, die stelt dat er tot 2030 voor onderhoud en reparaties nog wel gebruik mag worden gemaakt van gerecyclede en geregenereerde koudemiddelen met een GWP tot 2500, weinig aan af.

De synthetische opvolgers van HFK’s, de HFO’s (hydrofluorolefines), doen het qua GWP meer dan prima, maar die liggen onder vuur vanuit de ook al aangescherpte PFAS-wetgeving. Bepaalde HFO’s kunnen namelijk in de atmosfeer afbreken tot TFA, een notoire ‘most wanted’ op de PFAS-verbodslijst, die via regen in het milieu terecht kan komen.

Fabrikanten van ULT- en cryovriezers zijn daarom overgestapt op natuurlijke koudemiddelen. Deze mengsels van gassen als ethaan, propaan en stikstof hebben een GWP van nagenoeg nul en zijn wat PFAS betreft volledig veilig. In dat overgangsproces blijkt de ene fabrikant wat verder te zijn dan de ander, wat net het verschil kan maken in de propositie, die op een zeker moment aan een klant kan worden voorgelegd.

“Bovendien’, vult Desiree aan, “maakt de vriezer van Haier gebruik van een speciaal 4-traps cascadekoelsysteem om de -150 °C mechanisch te bereiken, is ons uitgelegd. In combinatie met de natuurlijke koudemiddelen levert dat een reductie tot maximaal 50% van het energieverbruik. Dat is natuurlijk mooi meegenomen, zeker in het perspectief van het Bronze LEAF-certificaat.”

Nog meer energiebesparing is haalbaar door de monsters onder stikstof te bewaren. “Er staan enkele stikstofvriezers in de kelder. Maar het is met onze routine van invriezen en ontdooien van cellen niet echt praktisch om daarvoor iedere keer naar de kelder te gaan. Het is echt wel een plus om een eigen vriezer in de buurt van de laboratoria te hebben. Bovendien: werken met stikstof ligt mij niet zo; er is toch altijd een risico dat het gaat spetteren.”

Die ‘schatten’ zijn met name humane neuronen en andere typen hersencellen, die worden gekweekt vanuit iPSC's: ‘induced Pluripotent Stem Cells’. Desiree legt uit hoe dat globaal in in zijn werk gaat. “Uitgangspunt bij veel van het onderzoek dat bij ons plaatsvindt zijn huidcellen (en soms ook wel bloedcellen) van patiënten met een neurologische aandoening. Die cellen kunnen we herprogrammeren tot pluripotente stamcellen, waarna we ze aan de hand van een specifiek inductieprotocol laten differentiëren naar bepaalde zenuwcellen. Afhankelijk van het type aandoening, dat je wil onderzoeken, kunnen dat corticale-, dopaminerge- of motorneuronen zijn, maar ook helpercellen als astrocyten en microglia. De kracht van deze opzet is dat je op dat moment de beschikking hebt over hersencellen met exact dezelfde mutatie als de hersencellen van de patiënt met de neurologische aandoening, die je wil onderzoeken. Met die cellen kan je allerhande assays uitvoeren en bijvoorbeeld nieuwe kandidaatgeneesmiddelen testen.”

Een veel gehanteerde read-out van die testen, die worden uitgevoerd op levende cellen, is calcium imaging. Hierbij kan onder een confocale microscoop gedurende meerdere weken aan de hand van de influx en efflux van calcium live de activiteit in de hersencellen worden gevolgd. Uit die activiteit kan je tal van parameters halen, die te maken hebben met de gezondheid van de cel: is er voldoende activiteit, werkt de cel synchroon met andere cellen, enzovoorts. Door dat patroon te vergelijken met de activiteit van gezonde cellen kan je ook een uitspraak doen over de effectiviteit van een compound op een of meer parameters. Na deze in vitro experimentele fase, die tot vier weken kan duren, worden de cellen gefixeerd om er eiwitspecifieke antilichaamkleuringen op te doen.

FGA huist in twaalf onderzoeksgroepen ruim 80 onderzoekers, inclusief twaalf research analisten, die ziektemechanismen in neurologische aandoeningen met een specifieke functie bestuderen. In de afgelopen jaren is met de toename van het aantal PI’s, en de daar aan gekoppelde groepen, het researchgebied sterk verbreed. Vanuit de historie, die een stuk verder teruggaat dan de oprichting van het CNCR in 2003, lag de focus op de pre-synaps en het STXBP1-syndroom (epilepsie, ernstige ontwikkelingsachterstanden en motorische problemen ten gevolge van het vanwege een zeldzame genmutatie disfunctioneren van het gelijknamige eiwit dat een cruciale rol speelt bij de communicatie tussen hersencellen).

Inmiddels wordt ook, vooral fundamenteel, onderzoek gedaan naar bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer, onder andere in de groep van PI Rik van der Kant, waar Jorin werkt. “We maken in dit geval vanuit de iPSC’s andere typen zenuwcellen dan de corticale neuronen, namelijk astrocyten en microglia. Deze helpercellen spelen een rol in Alzheimer, met name bij lipide ophoping en gliosis, de vorming van een soort van littekenweefsel na een ontsteking. We kijken onder meer naar het verband met bepaalde genen, zoals bijvoorbeeld APOE3 en -4, waarvan de corresponderende eiwitten respectievelijk neutraal en risicoverhogend zijn voor de incidentie van Alzheimer. Daarbij proberen we inzicht te krijgen in de onderliggende lipidenmechanismen en verbanden te leggen met de bekende fenotypen zoals verhoogde niveaus van amyloïd- en tau-eiwitten”, legt Jorin uit.

Het platform van Neurospector voor het onderzoeken van de effecten van componenten op humane iPSC-derived neuronen.

In het geval van Desiree geldt dat ze bijna exclusief voor Neurospector werkt, dat in 2019 vanuit de VU en het AmsterdamUMC is opgericht als valorisatie afdeling. “Doel van Neurospector is het helpen van farmabedrijven in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen voor neurologische aandoeningen, met de focus op pre-klinisch onderzoek. We zijn hiermee gestart omdat we zagen dat er veel vraag was vanuit de farmabedrijven om samen te werken met de academie. En om meer specifieke vragen te kunnen beantwoorden over de nieuwe medicijnen die ze aan het ontwikkelen zijn”, vertelt Claudia Persoon, hoofd van Neurospector.

Wat Neurospector onderscheidend maakt is de nabijheid van al die andere onderzoeksteams binnen het CNCR, met name FGA. “Innovaties uit het meer fundamentele onderzoek kunnen we implementeren in pre-klinisch onderzoek. Dat werkt twee kanten op, waarbij fundamenteel en preklinisch onderzoek elkaar versterken. Zo krijgen we vanuit bedrijven vaak de vraag om onder veel verschillende condities te testen. Hiervoor hebben we onze meetsystemen, kweekprocedures en microscopie aangepast en de assays geoptimaliseerd, zodat we met 96- of zelfs 384-well’s platen kunnen werken. Daar gaan nu ook PhD’s van andere groepen mee aan de slag. Bovendien zijn de postdocs in ons team naast de CRO-werkzaamheden ook gewoon bezig met hun eigen, academisch onderzoek”, aldus Claudia

Humane iPSC-derived neuronen maken zeer specifiek pre-klinisch onderzoek mogelijk voor neurologische aandoeningen. “In het algemeen hebben we het over hele complexe ziektes, met fenotypes die je niet een op een kunt terugvinden in proefdieren. Daarbij worden tegenwoordig veel therapieën op basis van een humaan gen ontwikkeld; denk alleen al aan gentherapie. Die kan je niet fatsoenlijk in een muismodel testen”, stelt Claudia.

Het zelf opzetten van een infrastructuur rond humane iPSC-derived neuronen is maar aan weinig farmabedrijven besteed. “De meeste bedrijven hebben daar de resources niet voor. Het vergt meerdere jaren en een flink team om zo'n iPSC-kweek echt goed op te zetten. Daar hebben wij (met een belangrijk aandeel van Desiree) de afgelopen jaren hard aan gewerkt. Met als resultaat een gestandaardiseerde kweekfaciliteit en vele specifieke microscopietechnieken waarmee we de communicatie van die zenuwcellen nauwkeurig in beeld kunnen brengen. Met circa 90 verschillende read-outs, inclusief elektrofysiologische metingen, kunnen we echt de diepte ingaan bij het testen van de effecten van kandidaatgeneesmiddelen. Vanuit die basis kunnen we op maat gemaakte projecten aanbieden, die zijn toegespitst op de onderzoeksvragen van bedrijven, die elke keer net wat anders zijn. Dat loopt prima. We hebben al meer dan 20 projecten uitgevoerd met bedrijven van over de hele wereld. Daarmee hebben we het team kunnen uitbreiden met meerdere analisten en onderzoekers. Het zal mij benieuwen wanneer de nieuwe -150 weer vol zit!”, lacht Claudia.