De nieren behoren samen met de hersenen en de lever tot de meest complexe organen. Pieter Leermakers, scientist bij ‘Kidney Physiology’ van het Radboudumc: “De functionaliteit van de nieren is enorm veelzijdig en de anatomie is zeer complex. Wereldwijd richten talloze onderzoeksgroepen zich op heel specialistische onderdelen daarvan. Zo ook onze groep, die zich bezighoudt met onderzoek aan de tubulus. De tubulus of nierbuisje maakt deel uit van een nefron, dat zorgt voor filtratie van het bloed, re-absorptie van voor het lichaam belangrijke stoffen als water, suikers en zouten, en secretie van afvalstoffen. Van die nefronen zitten er zo’n miljoen in elke nier. De tubulus zit in dat filterproces achter een ander onderdeel van het nefron, het nierlichaampje, dat pre-urine maakt door vloeistof uit het bloed te persen. Die pre-urine wordt verder bewerkt in de tubulus, die weer uit verschillende segmenten bestaat met ieder zijn eigen functie. Als groep zijn wij vooral geïnteresseerd in ziektebeelden waarbij de tubulus betrokken is, met name die te maken hebben met afwijkingen in de magnesium huishouding. Door met name fundamenteel onderzoek proberen we de mechanismen daarachter te ontrafelen. In die ziektes is ook weer een grote variëteit, van chronisch nierfalen dat veel mensen treft tot hele zeldzame genetische mutaties bij wereldwijd soms maar enkele tientallen mensen. We verdelen onze aandacht over de volle breedte van dat palet.”

Kleuring van verschillende segmenten van de nierbuis. Elke kleur stelt een ander type segment voor.

Verschillende effecten

Ziektes of genetische aandoeningen kunnen zich op verschillende manieren etaleren in de tubulus. “Bij erfelijke ziektes is er vaak iets mis met een eiwit. Het vouwt niet goed waardoor het disfunctioneert, of het is zelfs helemaal afwezig. Effecten kunnen dan zijn dat een bepaald type ion niet goed kan terugkomen in het bloed. Of er treden morfologische veranderingen op, iets wat je ook vaak ziet bij ziektes waar geen genetische component aan kan worden gehangen. Bepaalde segmenten van de tubulus kunnen bijvoorbeeld onder bepaalde condities onderling in lengte veranderen. Als een van de segmenten van de tubulus relatief groter of kleiner wordt, kan het zijn dat die tubulus beter of slechter in staat is om bijvoorbeeld magnesium terug in het bloed te krijgen. Een proces, waar ook weer verschillende eiwitten aan te pas komen”, somt Pieter op.

Met zoveel mogelijke actoren is het niet altijd even gemakkelijk om een duidelijke relatie te leggen tussen afwijking en effect. “Als een eiwit niet goed functioneert hoeft dat niet één op één zichtbaar te zijn in een verminderde opname van een ion. Het kan ook leiden tot een secundair effect, bijvoorbeeld een korter tubulair segment, met weer heel andere gevolgen.”

Fluorescentiemicroscopie

Het microscopisch onderzoek aan het doorzichtige nierweefsel vindt plaats bij de centrale lichtmicroscopiefaciliteit, één verdieping onder ‘Kidney Physiology’ in het researchgebouw. Hier staan veertien microscopiesystemen ter beschikking van onderzoekers van het Radboudumc. Het aanbod varieert van microscopen voor live imaging en een drietal confocale systemen (de ‘werkpaarden’) tot een light-sheet systeem en microscopen voor superhoge resolutie.

Pieter Leermakers is met zes collega’s van andere onderzoeksgroepen trekker van deze faciliteit. “Voor het nieronderzoek biedt de faciliteit verschillende technieken. Voor grote samples is dat light-sheet microscopie, oftewel SPIM, wat staat voor ‘Selective Plane Illumination Microscopy’. Hierbij stuur je het licht horizontaal het sample in, waardoor je geen excitatie van fluoroforen krijgt buiten het vlak waarin je wilt meten. Dat levert een relatief nauwkeurig 2D-plaatje, terwijl je toch een heel groot 3D-volume hebt. Een andere optie is confocale microscopie. Dat levert veel hogere resoluties op, maar daar ben je wel wat beperkt door de werkafstanden van de objectieven die je gebruikt. En over het algemeen is laserscanning microscopie veel langzamer, omdat je pixel per pixel je plaatje opbouwt. Light-sheet is echt een widefield methode; die is dus veel sneller.”

Voor de resolutie hoeft overigens niet het onderste uit de kan te worden gehaald. “Doel is om de afzonderlijke tubuli in beeld te krijgen. Zo’n tubulus bestaat in doorsnede uit een tubulaire wand van één celbreedte dik, een lumen en dan weer een tubulaire wand van één celbreedte dik. Dat hele complex is een soort van buis van 20 tot 40 micrometer dik, die we in beeld willen onderscheiden van de buis die ernaast ligt.”

Het hele plaatje

De groeiende behoefte om te overzien wat er in de hele nier gebeurt, welke systemische effecten er zijn, brengt ook een verschuiving in de onderzoeksbenadering met zich mee. “Lange tijd lag de nadruk op studies waarin we specifiek naar één eiwit keken. Dan brachten we bijvoorbeeld in knock-out experimenten dat eiwit niet tot expressie en keken we naar de effecten: komt er meer of minder magnesium in het bloed; zijn er morfologische veranderingen in bepaalde delen van de tubulus? Dat leverde op zich waardevolle resultaten, maar wel op een relatief beperkte reikwijdte. Zoals ik eerder al zei behoort de nier tot de complexere organen van het lichaam. Er zitten enorm veel verschillende celtypes bij elkaar, die allemaal de hele tijd met elkaar communiceren. Als je ergens iets verandert zal dat niet alleen een lokaal effect geven, maar ook de communicatie met andere celtypes verstoren, met alle mogelijke gevolgen vandien. Als je dat goed in kaart wil brengen zal je meer naar het systeem moeten kijken in plaats van naar één klein segment of één celtype.”

Van 2D naar 3D

De conventionele methode om de morfologie van de tubulus te onderzoeken is het prepareren van de muizennier en daarvan coupes maken, die je al dan niet gekleurd voor een specifiek eiwit of segment, bekijkt onder een fluorescentiemicroscoop. “Uit zo’n 2D-beeld halen we best wel veel informatie, maar je krijgt altijd maar een beperkt deel van het geheel in beeld. En zo’n tubulus is een 3D-structuur pur sang, die helemaal door de nier loopt. Vanuit de 2D-coupes is het heel lastig om te meten hoe lang zo’n tubulus nu precies is en hoe groot de verschillende segmenten ten opzichte van de totale lengte van de tubulus zijn, hoe ze in lengte veranderen bij bepaalde condities of ziektebeelden. Idealiter zou je de 3D-structuur van de tubulus in beeld willen krijgen, of liever nog de hele nier, in het geval van de muis een orgaantje van circa 8 mm doorsnede”, vertelt research technician Caro Bos, die veel van het experimentele werk uitvoert.

Een tubulus is een 3D-structuur pur sang, die helemaal door de nier loopt

Scientist Pieter Leermakers richt zich bij ‘Kidney Physiology’, naast eigen research, op de ontwikkeling van nieuwe technieken. Daarnaast besteedt hij een dag per week aan ondersteuning vanuit de microscopiefaciliteit.

Alle stoorzenders weg

Om een 3D-stuctuur als de muizennier geschikt te maken voor 3D-beeldvorming is het zaak om stoorzenders, zoals rode bloedcellen en lipiden te verwijderen. En dan zodanig dat dit niet ten koste gaat van de 3D-structuur. “De bloedcellen kunnen vrij eenvoudig met een fysiologische oplossing uit de nier worden gespoeld. Lastiger is het om de lipiden netjes te verwijderen. Je kunt dat proberen met oplosmiddelen, maar dat zijn geen prettige stoffen om mee te werken. Bovendien is het een heel arbeidsintensieve klus, die veel opeenvolgende handelingen vraagt. We hebben daarom gezocht naar een alternatieve methode, die deze nadelen niet heeft. Die hebben we gevonden bij Westburg Life Sciences, die ons attendeerde op het X-Clarity Tissue Clearing System II van Logos Biosystems. Deze instrumentele methode wordt veel gebruikt door hersenonderzoekers, maar is inmiddels ook bij verschillende groepen te vinden die zich bezighouden met nieronderzoek. En sinds eind vorig jaar dus ook bij ons”, vertelt Caro.

Geclearde (links) en niet-geclearde (rechts) muizennier.

Elektroforese

Het X-Clarity-systeem verwijdert de lipiden in een driestaps proces. De eerste stap is infusie met een acrylamide-gebaseerde hydrogel-oplossing en een polymerisatie-initiator. Vervolgens wordt door polymerisatie het weefsel ingebed in de hydrogel. De gebruiker kan voor deze stap onder meer temperatuur en tijdsduur instellen. De ingebedde weefsels worden vervolgens in een ander apparaat geplaatst, waar op basis van elektroforese de vetten er letterlijk uit worden getrokken. Ook deze stap is op allerlei manieren te regelen met variabelen als voltage, temperatuur en tijdsduur. Het resultaat van dit proces is een optisch transparante weefsel-hydrogelhybride, die geschikt is voor allerhande soorten van labeling en 3D-beeldvorming.

Magnesium als supplement?

Slappe spieren, slecht slapen, een futloos gevoel? Als je influencers mag geloven is dat te wijten aan een magnesiumtekort in je bloed. En kan je dat verhelpen door niet bijster goedkope magnesiumsupplementen te slikken.

De vakgroep Kidney Physiology kijkt daar vanuit de wetenschap genuanceerder naar. De visie van de vakgroep is dat een magnesiumtekort ontstaat bij mensen die echt een bepaalde ziekte hebben. En dat het alleen maar zin heeft om een magnesiumtekort aan te vullen op het moment dat een arts daar aanleiding toe ziet.

Er zit ongeveer 0,8 millimolair magnesium in je bloed en het is belangrijk dat dat goed gereguleerd is. Bij vrijwel iedereen gaat dat prima. Als je normaal eet en je hebt geen genetische afwijkingen die impact hebben op het magnesiumgehalte, dan is het eigenlijk altijd goed.

Bij veel mensen die nu magnesiumsupplementen slikken, heeft dat geen enkel effect. Het is ook niet schadelijk, want je plast het gewoon uit. De echte pijn zit hem in je portemonnaie!

Het vinden van de balans in de clearing, dus hoeveel je van het weefsel weghaalt en wat je nog overhoudt om mee te werken, is best wel uitdagend

Caro Bos deelt als enige research technician van ‘Kidney Physiology’ het laboratorium met twee collega’s van de vakgroep ‘Molecular Physiology’, die beide deel uitmaken van de afdeling ‘Medical Biosciences’.

Optimaliseren

De eerste ervaringen met het systeem zijn positief. “De bediening is duidelijk en we merken dat we er minder tijd mee kwijt zijn dan met het handmatig klaren van de nieren. Dat wil nog niet zeggen dat we al een uitgekristalliseerde workflow hebben. Dat vergt nog optimalisering. Je wilt in principe alles wat het licht tegenhoudt of verstrooit verwijderen. Maar daarin moet je niet te ver gaan, want dan kan het zomaar gebeuren dat je dingen die je wilt meten kwijt bent. Het vinden van de balans in de clearing, dus hoeveel je van het weefsel weghaalt en wat je nog overhoudt om mee te werken, is best wel uitdagend. En ook hoe je dat het beste kunt doen: hogere voltages gebruiken voor de elektroforese, langer over de elektroforese doen, de temperatuur aanpassen. Opties te over!”, aldus Caro.